植物基因工程課件

下面是小編蒐集整理的植物基因工程課件，希望對大家有幫助！

植物基因工程課件

（1）植物基因轉化受體系統的條件

（2）植物基因轉化受體系統的類型和特性。

（3）植物基因工程載體的種類和特性

（4）根癌農桿菌Ti質體的結構與功能：T-DNA、Vir區操縱子的基因結構與功能。

（5）農桿菌Ti質體基因轉化機理

（6）農桿菌Ti質體的改造及載體構建

（7）載體構建中常用的選擇標記及報告基因

（8）根癌農桿菌的轉化程序及操作原理

（9）外源基因在植物中的表達

瞭解植物基因轉化受體系統的類型、特性掌握Ti質體的結構與功能，植物載體構建原理，植物基因工程常用的載體類型。

重點

根癌農桿菌Ti質體介導的基因轉化的原理和方法

難點

植物載體構建原理

關鍵點

轉基因植物的獲取和檢測

教學目的和要求

教材分析

主要教具和設備材料

投影儀、電腦、常規教學設備板書與多媒體授課相結合

教法 思考題

1. 植物基因工程載體種類？

2. 根癌農桿菌轉化程序？

心得

在自然界的許多雙子葉植物中，常常發生一種嚴重危害植物生長的病害——冠癭。已知90多科，600多種雙子葉植物都能感染這種病。一般認為單子葉植物和裸子植物對此病不敏感。70年代中期，世界上幾個實驗室發現誘發腫瘤的根癌農桿菌中含有大量的誘瘤質體Ti(tumor-inducing plasmid),且證實了腫瘤的形成正是由於pTi中的特定片段——T-DNA轉移並穩定地整合進植物細胞核基因組中的結果；由於其上載着的冠癭鹼合成基因和激素合成基因表達，因此分泌冠癭鹼並形成腫瘤。人們就把這種冠癭的形成過程稱作天然的植物細胞轉化系統。

農桿菌將自身的DNA插入植物細胞誘發腫瘤只對其本身是有益的，重要原因之一是因為農桿菌誘發植物細胞合成冠癭鹼為自己提供食物。植物自身不能利用這種物質，只能為它的合成付出代價，別的細菌也不能利用它，在自然條件下，只有農桿菌能分泌分解冠癭鹼的酶，將這些特異產物作為唯一的碳源和氮源來利用。

腫瘤的產生是由於T-DNA上的激素合成基因所致，刺激細胞生長而產生腫瘤，這是T-DNA轉入的一個副產品。

Ti質體給自己設計出一套為其自身存活的非常優秀的進化格局：它感染植物細胞，使之出現愈傷組織增生，後者便產生出供帶有Ti質體的細菌用作能源、碳源和氮源的冠癭鹼；而冠癭鹼的產生又可激發Ti質體轉移到原先沒有存在這種質體的土壤農桿菌中去，如此周而復始得到不斷髮展。

Ti質體是一類理想的植物基因工程載體，通過它們可以將外源DNA轉移到植物細胞，並再生出能夠表達外源基因的轉基因植物。 Ti質體還具有若干其他載體所不具備的優點：

（1）T-DNA能夠進行高頻的轉移，而且這種轉移的DNA通常是以未發生變化的完整形式整合到植物的核基因組上。

（2）Ti質體不存在包裝限制問題，大到50kb的外源DNA也能順利地包裝與轉移。

一、植物基因工程載體種類

據載體的功能和構建過程，可把有關載體分為四大類型（九種載體）。 克隆載體、中間載體、卸甲載體、轉化載體

據載體的功能和構建過程，可把有關載體分為四大類型，九種載體。

1、克隆載體（目的基因的克隆載體）

通常由多拷貝的小質體為載體 功能：保存和克隆目的基因。

2、中間載體又分為中間克隆載體和中間表達載體。

中間克隆載體：由大腸桿菌質體插入T-DN段及目的基因、標記基因等構建而成。

功能：構建中間表達載體的基礎。

分為：中間粘粒載體、質體粘粒癒合載體、基因標記載體。 中間表達載體：含有植物特異啟動子的中間載體

功能：作為構建轉化載體的質體。

3、卸甲載體

解除武裝的Ti質體或Ri質體。（onc+ -------- onc-） 功能：作為轉化載體的受體質體

4、轉化載體

最後用於目的基因導入植物細胞的載體，亦稱工程載體。 它是由中間表達載體和卸甲載體構建而成。

分為一元載體系統（順式載體）和雙元轉化載體系統（反式載體）。 一元載體系統包括共整合載體和拼接末端載體（SEV）。

二、根癌農桿菌Ti質體

1、Ti質體的類型、結構與功能

（1）類型

Ti質體是根癌農桿菌染色體以外的遺傳物質，為雙股共價閉合的環狀DNA分子，分子量為95~156 x 106D，約150 ~ 200 Kb長。根據其誘導的冠癭鹼種類不同，Ti質體可分為三類： 章魚鹼型（octopine）：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162 胭脂鹼型（nopaline）：pTiT37, pTiT38, pTiC58

農杆鹼型（agropine）和農杆鹼素型（agrocinopine）或琥珀鹼型（succinamopine）

（2）結構和功能

各種Ti質體都可分為四個區：

①T-DNA區（transferred-DNA regions）：是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質體上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA。該DN段上的基因與腫瘤的形成有關。

②Vir區（Virulence region）：該區段上的基因能激活T-DNA轉移，使農桿菌表現出毒性，故稱之為毒性區。T-DNA區與vir區在質體上彼此相鄰，合起來約佔Ti質體DNA的1/3。

③Con區（region of replication）：質體結合轉移位點編碼區，該區段上存在着與細菌間接合轉移的有關基因（tra），調控Ti質體在農桿菌之間的轉移。冠癭鹼能激活tra基因，誘導Ti質體轉移，因此，稱之為接合轉移編碼區。

④Ori區（origin of replication）：該區段基因調控Ti質體的自我複製，稱之為複製起始區。

3種成分與Ti質體腫瘤誘導有關:

T-DNA：它可轉移至宿主細胞，是一種可移動因子。

毒性區：vir基因可產生轉移活動蛋白，對增強植物細胞的轉化是必須的。 土壤農癌桿菌染色體基因:間接參與轉化，負責將細菌細胞接合於植物上。

2、T-DNA的基因結構和功能

（1）T-DNA的結構特點 長約23Kb

在T-DNA的5’和3’端都有真核表達信號，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。

T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重複序列，即邊界序列，分別稱之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。該25bp邊界序列屬保守序列（TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC）。通常右邊界序列更為保守，左邊界在某些情況下有所變化。左邊界的缺失突變仍能致瘤，但右邊界缺失則不致瘤，這時幾乎完全沒有T-DNA的轉移，這説明右邊界在T-DNA的轉移中的重要性。

胭脂鹼型腫瘤，為一連續的一段序列，長約23.4Kb，有腫瘤系，僅一個拷貝，有的T-DNA是多拷貝的。

章魚鹼型腫瘤：T-DNA分左右兩部分（TL-DNA和TR-DNA），各自帶有左右邊界序列。左區的順序變化不大，長度約13Kb，通常一個拷貝，但也有幾個拷貝首尾相連排列。含章魚鹼合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA較短，長約6-7Kb，拷貝數達數個 或數十個，有的腫瘤系中沒有TR-DNA。TR-DNA編碼5個基因，如甘露鹼和冠癭鹼合成酶基因。

（2）T-DNA上的編碼基因及功能

章魚鹼型和胭脂鹼型T-DNA的轉錄有下述共同特點： T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈；

T-DNA上每個基因都有各自的啟動子； 基因的轉錄由植物細胞RNA聚合酶II完成；

T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調節信號，在其5’端轉錄起始處有TATA和CAAT盒。另外，至少在5個T-DNA基因中發現有一個8bp的相同順序（TTTCAA GA），同時AATAAA加尾信號也在同一條鏈上發現。

植物或農桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調節基因活性。 3、Vir區操縱子的基因結構與功能

毒性區的大多數基因產物都控制T-DNA的轉移，這個區域的突變往往導致農桿菌感染植物能力的下降。

（1）Vir區操縱子的基因結構

章魚鹼型Ti質體：Vir區大小為40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H（PinF）等8個操縱子，共24個基因。大多數操縱子含有多個基因VirA（1）、VirB（11）、VirC（2）、VirD（4）VirE（2）、VirF（1）、VirH（2）。

胭脂鹼型Ti：有7個操縱子，少一個VirF，它們的第一個操縱子也不同，章魚鹼型Ti是VirH，而胭脂鹼型Ti是Tzs，其功能也不同。 Vir區基因的表達有兩種方式：

組成型表達；在無植物誘導分子存在下依然保持一定的表達水平，virA，virG、virH 誘導型表達：這些基因的表達必須在土壤農桿菌感染植物時，在植物受傷組織分泌的信號分子作用下才能啟動表達，如virB、C、D、E

virG雖屬於組成型表達，但有植物信號分子存在下表達量提高10倍，也具誘導表達特性。

（2）Vir區操縱子的基因的功能

①Vir A 單個基因，2.4kb，僅編碼一條多肽。Vir A編碼一種結合在膜上的化學受體蛋白（92KD），可直接對植物產生的酚類化合物感應，是一種感應蛋白。

Vir A的活化：當AS與Vir A的受體部分結合後，會使整個Vir A蛋白構象發生變化，其C端活化。Vir A蛋白的胞質區有自激酶的功能，可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，從而Vir A蛋白被激活。激活後的Vir A具有轉移其磷酸基至Vir G蛋白的一個宿存的天冬氨酸殘基的能力，使Vir G蛋白激活。

②Vir G Vir G ，只有1Kb，單基因，編碼DNA結合蛋白,其C端有DNA結合活性，N端具有磷酸化的酸性結構。

從總體效應講，Vir G基因是屬於組成型表達的，這對於細菌迅速地將外部環境信號傳遞到細胞內十分有利。

當磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉到Vir G保守的天冬氨酸殘基上時，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二體或多體形式結合到Vir啟動子的特定區，從而成為其它Vir 基因轉錄的激活因 子，打開Vir B、C、D、E、H等幾個基因。Vir A或G突變後會減弱或完全失去對其他Vir 位點活化的誘導，VirA及 Vir G 的這種調控作用被稱為雙因子調控體系。 ?Vir H、Vir F及Tzs

這些基因對質體是特異的，在章魚鹼型中有Vir F、Vir H，在胭脂鹼型中有Tzs。

Vir H：對植物產生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使自身生不受抑制，可增強致瘤能力。

Vir F：編碼一個23KD蛋白，通過Vir 系統傳遞到植物細胞中，對T-DNA起運輸作用。

Tzs：大部分胭脂鹼型菌株的Ti質體上均有Tzs基因，轉運玉米素合成酶基因，在細菌中表達後將玉米素分泌到細胞外。該細胞分裂素被植物吸收後，能促進農桿菌感染部位的植物組織脱分化和細胞分裂，提高植物對農桿菌轉化的感受性。

三、農桿菌Ti質體基因轉化機理

1. T-DNA的加工及轉移

首先在下鏈25bp重複序列的右邊界左起第3和第4鹼基間剪切，從缺口的3’端開始合成新的DNA鏈，並一直延伸到左邊界第22bp處。置換出原來的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。

VirD蛋白的功能：VirD1及 VirD2分別編碼16KD和47KD蛋白，與T-DNA的加工有關，決定在邊界重複序列的特定位點上形成切口，產生T鏈斷裂。 VirD2蛋白的功能：①特異剪切，並與T鏈的5’端共價結合。②導向功能；

2.T鏈蛋白複合體的形成及VirE的功能

T鏈必須橫向跨越細菌細胞膜、細菌細胞壁、植物細胞壁、植物細胞膜及核膜才能整合進植物基因組。

T鏈以一種DNA-蛋白複合體（T複合體）的形式存在。

目前已知至少兩種Vir特異蛋白即VirE2和VirD2與T鏈蛋白複合體的形成有關。

VirE2的功能：編碼ssDNA結合蛋白，該蛋白可非特異地一與任何ssDNA結合，通過與T鏈非共價結合，VirE2可包被T鍊形成細長的核-蛋白絲，使ssDNA抗3’和5’外切核酸酶和內切核酸酶。

3、T鏈複合體通過細菌細胞膜的轉運及VirB的功能

（1）VirB的功能

VirB啟動子有11個基因，大多數編碼跨膜蛋白或膜結合蛋白，能在膜上形成一種類似細菌接合轉移時從供體菌轉至受體菌所必須的結構——接合孔或性毛。T-DNA通過這種孔由細菌進入植物細胞。同時，VirB也可能起運輸和提供能量的作用。 按功能，可將VirB蛋白分成五類：

R：在內膜上或內膜內的某些蛋白，可能作為T複合體的受體；

A：此類蛋白可能作為能源，作為一種ATP酶促進T複合體被泵出細菌細胞，VirB11可能是這種A類蛋白。

C：形成通道的作用，如：VirB4是一種富集蛋白，無疏水區，無信號肽，可能在T鏈轉運中起一種結構作用，形成至少一部分特殊的通道結構。

S：載體蛋白，起運載T 複合體穿過通道的作用，這類蛋白可能與所有膜成分（內膜、外膜及周膜）有關。

P：位於外膜上，可能作為結合植物細胞膜的一種受體。

（2）T複合體向植物細胞核的轉運

VirD2可能以一種極性方向，將T複合體定向至核孔，而VirE2則作為一種促進因子，保證很長的T複合體在進入核孔時不受干擾。 在T-DNA轉移過程中，VirD2具有火車頭的作用，牽制T複合體以5’端到3’端的方向向核遷移，而VirE2則只助推器的角色，幫助未摺疊的長形T複合物不被打斷，並方便其向核運動。 已知VirE2-ssDNA可以抗拒內切酶的作用，如核酸外切酶VII對VirE2-ssDNA降解能力將相當於對ssDNA的6%，對S1核酸酶的效果也相似。

4、細菌染色體上與T-DNA轉移有關的基因

目前已知農桿菌染色體上有10個基因與T-DNA轉移有關，它們主要涉及細菌與植物細胞的接觸和細菌向植物傷口的趨化性。

chvE——編碼一個葡萄糖和半乳糖結合蛋白，主要結合組成植物細胞壁的單糖；可能由於識別植物受傷產生的糖單體，導致細菌向植物傷口的趨化性；在低pH值、磷酸飢餓條件下啟動VirG表達。

chvD——編碼一種細菌ATP結合蛋白，在低pH值、磷酸飢餓條件下誘導VirG蛋白含量升高，然後VirA接受AS信號，刺激VirG轉化成活性形式，啟動其他VirG 基因表達。

chvA 、chvB、 chvC——與環狀?-1，2-葡聚糖的合成和運輸有關； chvB產物催化合成葡聚糖， chvA產物將多糖從胞質運到胞外，影響農桿菌對植物細胞的附着能力。

pscA和Exoc——與多糖的合成有關，並影響農桿菌對植物細胞的附着能力。

四、農桿菌Ti質體的改造及載體構建

1、野生型Ti質體直接作為基因工程載體的障礙：

（1）分子量大，160~240Kb；

（2）有各種限制性內切酶的多個切點；

（3）T-DNA區中含有許多編碼基因與基因轉移無關，如致瘤基因，其存在還會導致植物體喪失形態發生能力；

（4）Ti質體不能在大腸桿菌中複製。

2、Ti質體構建的幾個重要因素

（1）右邊界序列；

（2）完整的Vir基因羣；

（3）有獨特的酶切點；

（4）有在植物中可表達的選擇性基因；

（5）有在細菌中可表達的選擇性基因；

（6）章魚鹼型農桿菌品系需要獨特的增強子。

3、載體構建

先將T-DN段克隆到大腸桿菌質體中，並插入外源基因，最後通過三親交配或接合轉

移把外源基因引入農桿菌Ti質體上。

Ti質體的載體系統分兩類：一元載體和雙元載體

例：雙元載體的構建

雙元載體系統由兩個分別含T-DNA和Vir區的相容質體構成。

（1）構建原理

Ti質體上的Vir基因可以反式激活T-DNA的轉移，T-DNA和Vir區處於不同的Ti質體上同樣能起到轉移T-DNA的作用。

雙元載體含有廣泛寄主範圍質體的複製起點（oriv），從而代替了在共整合載體中用以重組的同源區，它們能在任何農桿菌寄主裏自發複製。所以寄主僅需一套完整的vir質體就可。主要的轉移區載在小重組Ti質體上。

（2）微型Ti質體（mini-Ti plasmid）

含有T-DNA邊界，缺失Vir基因的質體；含廣譜質體的複製位點OriV及選擇標記基因。

（3）輔助Ｔｉ質體

含Vir區段的Ti質體，helper Ti,是T-DNA缺失的突變型Ti（卸甲Ti），提供Vir基因功能，反式激活T-DNA的轉移。

LBA4404中含有pAL4404(pTiAch5的衍生質體)，野生型Ti也可做Helper Ti,有更強的毒性。

五、根癌農桿菌侵染植物細胞的機理

1、根癌農桿菌的生物學特性

分類

農桿菌屬，也稱土壤桿菌屬和根瘤菌屬，是同屬於根瘤科的革蘭氏陰性菌。

土壤桿菌屬有4 個種：根癌農桿菌、放射形農桿菌、毛根農桿菌和懸鈎子農桿菌。

根癌農桿菌，根據其誘導植物細胞產生的冠癭鹼種類不同可分為三種類型即章魚鹼型、胭脂鹼型和農杆鹼型。

生活習性

土壤桿菌屬都是土壤習居菌，主要生活在曾被多種植物生活過的土壤中，好氧，但也能在低氧壓的植物組織中生長，最適温25~30℃，pH4.0~12.0,最適pH6.0~9.0。 形態結構

農桿菌細胞呈杆形，0.8x1.5~3.0μm,以1~4根周生鞭毛運動，不形成芽孢，菌落無色，隨菌齡增加，光滑的菌落逐漸變成有條紋，但也有許多菌株生成的`菌落呈粗糙型。 寄主範圍

根癌農桿菌廣泛存在於雙子葉植物中，根據不完全統計，約有93屬643種雙子葉植物對根癌農桿菌敏感。裸子植物對該菌同樣具敏感性，能誘發腫瘤，對絕大多數單子葉植物無侵染能力。

2、根癌農桿菌侵染的誘導信號及作用機理

（1）酚類化合物

酚類物質——農桿菌浸染植物細胞所必需的誘導物，同時將其作為趨化物來識別。 實驗證明，一些植物中常見的酚類化合物的混合物都可激活Vir區基因。如：兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、β-羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草醛。

Stachel等在煙草葉片的傷口誘出液中確認了兩種主要的Vir區基因誘導物：乙酰丁香酮AS和羥基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.5~1.0μmol/L即可誘導Vir活化。

（2）中性糖和酸性糖

中性糖在Vir基因誘導和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS誘導條件下，

發現許多中性糖（L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔羅糖、2-去氧-D-葡萄糖）都可增強一些Vir區基因的誘導。這些中性糖是通過chvE和VirA起作用，chvE編碼葡萄糖和半乳糖結合蛋白，識別傷口產生的糖單體，導致農桿菌的趨化作用。

酸性多糖是組成植物細胞壁中果膠質的主要成分。最近的實驗證明，酸性糖（胡蘿蔔根提取物中蒸餾出來）可改變農桿菌基因的表達。蛋白質標記實驗表明，至少有10種蛋白質合成被其誘導，一種被阻遏。

（3）pH值

5.0~5.5的低pH值。誘導物對pH的要求是<.6.0, 在農桿菌培養在含有酚類化合物（AS）的培養基中時，pH5.0 ~5.8Vir的誘導達到一個最高水平

3、根癌農桿菌的侵染能力及其特異性

（1）常用的根癌農桿菌

胭脂鹼型（Nop）菌株：染色體背景為C58，生長快，不結球，轉化中容易操作，常用的菌株有C58、pGV3850、A208SE等。

章魚鹼型（Oct）菌株：染色體背景為Ach5，生長慢，結球，轉化中難操作，培養後不易洗掉，常用的菌株有LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61等。

農杆鹼型（Agr）菌株，也稱琥珀鹼型（Suc）：染色體背景為A281或A136，具有胭脂鹼型菌株的特點，以A136為染色體背景的常用菌株是EHA101，生長快，不結球，侵染能力強，常用的菌株有A281、EHA101、EHA105等。

（2）、根癌農桿菌的侵染能力差異

根據侵染能力大小將農桿菌分為：

廣宿主菌株：大多數雙子葉、若干裸子植物、少量單子葉植物；如：pTiB0542、pTiA6； 窄宿主菌株：有限的幾種植物上誘發腫瘤，如pTiAg162,僅能在葡萄的幾個品種上誘發腫瘤。 不同植物對農桿菌侵染的敏感性不同，在轉化中，二者的選配十分重要，要選農桿菌與植物之間有高侵染力的配合。如：楊樹莖，用C58優於LBA4404；蘋果，6種基因型比較，葉：EHA101（pEHA101）優於LBA4404，C58；莖：A281優於C58，ACH5，A348。

農桿菌的染色體背景對宿主範圍同樣有着重要作用。因為除Vir區功能外，農桿菌對植物表面識別與結合有關的功能還取決於農桿菌染色體上基因位點。農桿菌所展示出不同的生長速率、多糖產生和對植物細胞的毒力都會影響轉化率和宿主範圍。

六、根癌農桿菌轉化程序及操作原理

1、根癌農桿菌Ti質體轉化的基本程序

（1） 選擇適宜的培養基，使創傷部位能產生儘可能多的再生植株。

（2） 確定供體植物最適的培養條件。

（3） 確定最佳外植體類型、大小、部位等：再生途徑，愈傷組織起源（細胞類型、層次），

保證轉化愈傷組織和芽原基由創傷部位的淺層細胞發育而來。

（4） 確定適宜的抗生素水平：抑菌抗生素Cef ，Cb ，能抑制細菌生長，還能保證愈傷組

織正常生長和分化。

（5） 確定選擇壓力的最低水平。

（6） 優化農桿菌接種和共培養條件改進篩選條件，促進抗性細胞恢復再生能力：採用無毒的生化物質。

2、根癌農桿菌的培養、純化、保存及工程菌液的製備

（1）農桿菌的培養

常用的農桿菌培養基有 LB、 YEM、 YEB、 TY、 523、PA及 MinA等培養基。

這些培養基中，LB、YEB、YEM及523屬富集培養基，其營養成分豐富，包括有各種有機成分。在這些培養基中農桿菌生長快，分裂旺盛，它們是常用 製備工程菌液的培養基。 ? PA和 TY培養基是屬營養較好的培養基，氨基酸及碳源、氮源都很豐富。農桿菌在這些培養基上生長也很快，是常用的農桿菌選擇培養時的培養基。

MinA培養基與前幾種培養基有明顯差異：只提供必要的無機鹽，並用葡萄糖和（NH4）2SO4 提供碳源和氮源。

Minimal只用相應的冠癭鹼如 NOpaline、 Octopine等取代蔗糖、氨基酸和無機氮作為農桿菌的碳源和氮源。

農桿菌在MinA和Minimal培養基上生長較慢。在進行三親雜交時通常用這兩種培養基，並加相應的抗生素選擇轉化的農桿菌。含重組質體的大腸桿菌及含輔助質體 pRK20 13的HB101因不能利用冠癭鹼作為碳源和氮源而不能生長，同時還存在抗生素的選擇，因此有利於選擇轉化的農桿菌的生長。

農桿菌的生長週期

農桿菌培養方式：分為固體平板培養和液體振盪培養，

固體培養一般需2～3d，液體培養生長更快，一般需1～2d。

農桿菌接種在培養液後，並不立即開始增殖。一般在25～30℃時，需1～2 h細菌才開始分裂。

當生長開始後，細菌數目以一恆定的指數速率倍增，直至培養基成分改變和供氧缺乏時才停止增殖。當細菌增長速率達到對數指數時稱之為對數生長狀態。

當細菌密度達到 177／ml時，空氣中的氧氣便難以很快地擴散到細胞內。在振盪或通氣條件下培養，細菌濃度也很少超過 2～3 X 109／ml。

測定農桿菌濃度的方法：最簡單的方法是光密度測定法。將菌液裝入比色杯汽在分光光度計上選用600nm波長測定其OD值。光密度與濃度換算公式是1OD約等於 8 X 108／ml。

（2）工程菌的純化

純化菌種的方法主要採用常規的微生物純化方法，即劃線法。用接種針劃線，然後用石蠟膜封口，將平皿倒置放恆温箱內，在25～28℃條件下培養過夜，次日或即日看到分離的單菌落。挑取單菌落接種在液體培養基內進行液體振盪培養。

（3）工程菌侵染懸浮液的製備

液體振盪培養的工程菌，通常培養 12～24 h後即可達到對數生長期。用離心管取一定數量的菌液進行4000r／min離心，倒掉上清液，再加入植物外值體誘導愈傷組織或分芽的液體培養基，使其光密度OD值達到0．5，即可用作接種外植體的工程菌液。

注意：因為農桿菌培養基中通常含有抗生素，它對外植體的生長、脱分化或分化有不良影響，放需通過離心除去細菌培養基，加入植物培養基。也有的做法是，將農桿菌加入植物培養基後再振盪培養 12 h，當細菌生長達到對數生長期後再離心，倒掉上清液，用新的植物液體培養基稀釋至一定OD值，再作為工程菌液使用。

（4）工程菌的保存

菌種的保存的目的是創造一個適合細菌休眠的環境（低温、乾燥、缺氧），使其得以長期保存。其功能在於儘量減少菌株的傳代次數；使菌種經保存後不死亡、不污染雜菌，並保持其原有性狀，降低菌種的變異率；最終目的是的基因不能丟失。

菌種保存的方法根據其保存時間長短可分為三種方法：

短期保存〔數月）：採用斜面或平板保存法。斜面菌種置於4℃可保存數月，平板用石蠟膜密封后也可在低温0～4℃下放置數月。

中長期保存（數年）：中長期保存採用穿刺法，這是一種菌種接入柱狀培養基的方法。經常應用的是半固體柱狀培養基，用接種針沾取少量問後直接插入柱狀培養基中。需注意的是，要從培養基中間插入，直插到接近管底，但不要穿透培養基，再慢慢按原途徑拔出接種針，切勿攪動，以免使接種線不整齊而影響觀察，甚至會因用力攪動造成空隙太大進入空氣，而影響保存效果。穿刺培養的菌種用蠟封口，在室温下可保存數年。

長期保存菌種：主要採用甘油保存法。在7％二甲基亞（DMSO）或 15％甘油中，菌種可於- 70℃冰箱或液氮中長期保存。當甘油含量增加40～ 50%時，細菌可在- 20℃或- 70℃條件下，保存若干年而不失活。將冰凍菌種從冰櫃中取出時，應當放在冰浴上慢慢融化，不可直接將其放室温下，否則會導致菌體失活，更不能直接接種至液體培養基內28℃振盪培養。

3、Vir基因活化誘導物的使用

（1）誘導物：

常用誘導物是乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（OH－AS），其中效果優是AS。但最近又有新的發現，有兩種特殊化合物比AS的誘導活性高10～100倍。

（2）誘導物的使用方法

在農桿菌液體培養時加 AS，加入時間－般在製備工程菌浸染液使用前4～6 h加入。使農桿菌既處於對數生長期，又處於vir基因高度活化狀態，從而提高侵染能力。也有的在農桿菌懸浮液離心後用植物外植體培養基稀釋成侵染液時加入。

AS加在農桿菌和外植體共培養的培養基中。共培養的過程是Ti質體實現 T-DNA轉化時期。一般農桿菌附着 16 h後才能進行轉化，這時需要vir基因的高度活化。因此，許多科學家贊成這種使用方法。

在農桿菌液體培養基中及共培養基中都加入AS。這種方法似乎最牢靠，只不過是使用的AS誘導劑太多了。

（3）誘導物使用的pH值

pH值對vir區的活化有着明顯的影響，從理論上講含AS的培養基pH值為5．0～5．6時， Vir區基因的誘導達到最高水平。

pH值改變 0．3，即對多種植物的轉化率有明顯影響。

章魚鹼型和農杆鹼型菌系比胭脂鹼型和琥珀鹼型需要更低的pH值。

通常農桿菌培養時pH值為7．2。這種生長旺盛的菌株的vir基因均處於不活化狀態。而組織培養基中的pH值常為5．8，有利於vir基因的活化。在vir基因活化誘導中應調整培養基的pH值。

4、外植體的選擇

Mayer等指出，轉化只發生在細胞分裂的一個較短的時期內，可能只有處於細胞分裂週期的S期才具有外源基因的轉化能力，因為核基因組DNA正在複製時才能使外源DNA整合。因此細胞具有分裂能力是轉化的基本條件。

（1）外植體的種類

葉片、葉柄、子葉、子葉柄、下胚軸、莖、花莖、匍匐莖、塊；莖尖分生組織、芽、根、合子胚或體細胞胚，以至成熟的種子等都可作為外植體轉化。但各種外植體材料的轉化率有明顯差異。

最佳共培養的時間：

農桿菌轉化時，並不“侵入”到植物細胞中去，而是把T－DNA轉移到植物細胞。農桿菌附着後不能立即轉化，只有在創傷部位生存16h之後的菌株才能誘發腫瘤，這一段時間稱為“細胞調節期”。因此，共培養時間必須長於 16h。共培養時間太長，由於農桿菌的過度生長，植物細胞因受到毒害而死亡。共培養時間對轉化率有着很大影響，而且不同物種、外植體種類、農桿菌菌株的最佳共培養時間不同。

確定最佳共培養時間的方法主要採用gus基因瞬時表達測定法，即共培養後定時測定外植體的gus基因顏色反應，統計瞬時表達率及表達面積，以表達率高，表達面積大為優。同時還要考慮外植體的受損害程度，以保證外植體的旺盛生長為直。最後還要以獲得的轉化愈傷組織頻率或轉化不定芽頻率為最終依據。

農桿菌的增殖適度

在共培養時農桿菌增殖生長不良，外植體切口邊緣只有很少的農桿菌生長，則轉化的概率很小。反之，農桿菌在外值體四周過度增殖，可引起對外植體的毒害，致使其褐化死亡。 控制農桿菌增殖適度的原則是既要使菌株在外植體邊緣特別是切口面旺盛增殖生長，又不應過度，一般以覆蓋切口面為適度。 控制農桿菌增殖的方法有以下幾種：

1）調整工程菌液的濃度，生長太快則應降低菌液濃度。

2）控制共培養時間，農桿菌的增殖生長適度也是確定共培養最佳時間的指標，共培養時間太長可造成農桿菌過度生長。

3）使用抗生素調控農桿菌的增殖生長。一種方法是在共培養基中加入適量的抗生素如羧苄青黴素或頭孢黴素。另一種方法是共培養2～3d後的外植體需用含抗生素的液體共培養基充分洗滌，以除去過量的農桿菌，然後轉到新鮮的共培養基上繼續共培養。共培養結束時若仍存在農桿菌過度增殖，則可再用上述洗滌培養基充分洗滌後進行愈傷組織誘導或不定芽分化培養 。 共培養中激素的影響

共培養時培養基中是否加激素，文獻報道不一，有的不加激素，有的則認為加激素後促進外植體細胞分裂，保持細胞活力，也有利於轉化後細胞的生長，從而提高轉化率。

如 Mansur等（1993）用 A281菌株與花生葉片外植體共培養時，加激素比不加激素的腫瘤誘導率提高約 30％。

目前大多數研究者採用加激素的方法，而且共培養基與愈傷組織誘導或不定芽誘導培養基相同。

（4）外植體脱菌及選擇培養 外植體的脱菌培養 脱菌培養，即把共培養外植體轉移到含有抗生素的培養基上。常用的脱菌抗生素有羧苄青黴素（Carb）、 頭孢黴素（Cef） 等。這些抗生素不僅對農桿菌有殺傷或抑菌作用，而且對植物細胞同樣有一定的生物效但對不同植物的不同外植體產生的影響不同。

Holford 等（1 992 ）指出，Carb 的分解物為生長素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈傷組織的增殖。Howe 等（ 1994 ）觀察到對楊樹的愈傷組織誘導有抑制作用。在甘藍研究中發現，Carb 抑制根分化，Cef 抑制芽分化，因此芽分化階段需用Carb， 生根階段則用Cef。 抗生素的使用濃度一般為500mg／L 左右。其使用原則是在達到抑制農桿菌生長的目的後，儘量降低其濃度。

脱菌培養的時間：脱菌培養的時間，一般需5～6次繼代培養，但仍然不能把殘留的農桿菌殺死，特別是共生在維管束和細胞間隙中的農桿菌。如果停止使用抗生素後的外植體又有農桿菌可再使用抗生素脱菌。也有的植物一直使用抗生素，直到試管苗形成。

（5）轉化體的選擇培養

?選擇壓： 選擇抗生素如 Km，加入選擇培養基後，對細胞的生長產生一種選擇作用，

稱之為選擇壓。加入的抗生素濃度愈大，選擇壓也愈大。選擇培養基中抗生素的濃度，即選擇壓的強度，也要根據植物的特性而定，較敏感的植物要用較低的 Km濃度。一般濃度範圍是 Km 50～ 100mg／L， hpt 10~20mg／L， ppt 5～20mg／L。

?選擇的方法：前期選擇、延遲選擇和後期選擇。

前期選擇：就是外植體共培養後，在轉入愈傷組織或不定芽誘導的一開始就加入選擇壓，相當於前面講到的先選擇後再生。

延遲選擇：當愈傷組織和不定芽誘導培養時開始不加選擇壓，過一週或一定時間後再加入選擇壓，這樣既有利於轉化細胞生長又不會產生更多的嵌合體 後期選擇：即相當於前面説的先再生後選擇，有利於提高轉化率。

選擇培養過程中轉化和再生細胞的一致性

在選擇培養條件下再生細胞和轉化細胞是否一致，關係到能否得到真正的轉化，只有同時具有再生和轉化潛力的細胞才有可能分化成轉基因植株。因此再生部位和可被轉化的細胞部位應該發源一致，反之得到的可能是假轉化體。假轉化體在繼代選擇培養基上生長不良而死亡，或呈白化。

七、根癌農桿菌Ti質體轉化的方法

1、整體植株接種共感染法

該途徑是模仿農桿菌天然的感染過程，人為地在整體植株成創傷部位，然後把農桿菌接種在創傷面上，或用針頭把農桿菌注射到植株體內，桿菌在植株體內進行侵染實現轉化，獲得轉化的植物細胞，因此也稱之為體內轉化。為了獲得更高的轉化頻率，一般採用無菌的種子實生苗或試管苗。它是最簡便的轉化法。

優點：

實驗週期短；

充分利用了這些無菌實生苗的生長潛力；避免在轉化中其他細菌的污染；菌株接種的傷口與培養基分離，以免農桿菌在培養基上過度生長，允許在無抗生素的培養基上進行；

具有較高的轉化成功率。

缺點：

轉化組織中常混有較多未轉化的正常細胞，即形成嚴重的嵌合體； 需要大量的無菌苗材料； 轉化細胞的篩選比較困難。

2、葉盤轉化法

（1）葉盤法轉化的操作

打孔器從消毒葉片上取得葉圓片

葉盤在過夜培養的對數生長期的農桿菌的菌液中浸數秒種後，置於培養基上共培養 待菌株在葉盤周圍生長至肉眼可見菌落時再轉移到含有抑菌劑的培養基中除去農桿菌。

同時在該培養基中加入抗生素進行轉化體選擇，3~4周培養可獲得轉化的再生植株。

優點：操作簡單、重複性高、適用性廣 （2）轉化苗的保持與繁殖

主要採用兩條途徑實現轉化苗的保持與繁殖。

營養繁殖途徑，它包括試管苗的無性快速繁殖及嫁接、扦插等田間的無性繁殖方式。 該途徑保持繁殖轉化苗時應注意如下：

①正確使用激素濃度，低水平的激素能有利於保持外植體活力，並刺激休眠側生分生組織的發育及側枝形成。適當提高分裂素濃度有利於芽的分化，形成原始轉化苗的無性系克隆。因此可根據實驗目的選擇細胞分裂的濃度。

②為消除殘留的農桿菌在繁殖培養基中加入抑菌抗生素是明智的種子繁殖：

這對於轉基因植株的正常表達、遺傳特性及向生產化過渡具有重要作用。該途徑的主要操作是將轉化試管苗在小花盆中移栽成活，然後轉入田間，開花時套袋隔離防止雜交授粉及向環境中釋放轉化的花粉。結種後注意收割種子，保存。

3、原生質體共培養轉化方法

（1）操作步驟：

①從葉片分離原生質體，在26t下暗培養24 h，然後轉移到2000lX下繼續培養48h；

②在細胞即將分裂，新的細胞壁物質已經形成時，加入活化的農桿菌懸浮液。農杆部原生質體的比例以1：1000左右為宜。共培養約2～3 d；

③再加入選擇標記的抗生素對轉化體進行選擇培養約3～4周後可產生肉眼可見的小塊轉化愈傷組織；

④將小塊愈傷組織轉移到固體培養基上再生愈傷組織，此時繼續保持選擇壓力，以便保證只有轉化愈傷組織才能不斷生長；

⑤將轉化愈傷組織轉入固體分化培養基，獲得轉化再生植株。其他步驟與葉盤法相同。

（2）原生質體共培養法的優點及一些技術問題原生質體的密度一般以105～106個／ml為宜。

在農桿菌和原生質體共培養期民農桿菌附着在原生質體上，超過32小時之後方可除菌洗滌，也就是要有一定的附着時間。

原生質體出現新形成的細胞壁物質是農桿菌轉化的基本條件，這是因為細胞壁物質與農桿菌的附着有關。未形成新細胞壁物質的原生質體沒有農桿菌的附着，也沒有轉化進行。 在共培養過程中，某些二價陽離子（Mg2+）為農桿菌的附着和轉化所必需。二價離子的整合物EDTA可以抑制農桿菌對植物細胞壁的吸附及轉化作用，因為上述 Mg2+（不是 Ca2+）與農桿菌附着到植物細胞壁有關。  共培養轉化似乎是在單細胞或二細胞階段發生，因此獲得的轉化愈傷組織大部分是來自一個細胞。

八、 癌農桿菌轉化系統的評述

優點：

成功率高，效果好。該轉化系統是模仿或稱之為利用天然的轉化載體系統，不管是用菌株接種整體植物的傷口，還是直接侵染離體培養細胞，通常都可以獲得滿意的轉化頻率。

在所有的轉化系統中，Ti質體轉化系統是機理研究得最清楚的，方法最成熟，應用也最廣泛。

Ti質體的T-DNA區可以容納相當大的DN段插入，目前已把長達50kb的異源DNA序列通過T－DNA完整地轉移到植物細胞中。

T－DNA上含有引導DNA轉移和整合的序列，以及能夠被高等植物細胞轉錄系統識別的功能啟動子和轉錄信號，使插入到T-DNA區的外源基因能夠隨同T-DNA一道在植物細胞中表達。

可根據人們的需要連接不同的啟動子，使外源基因能夠在再生植株的各種測器官中特異性表達，例如在果實中表達，在葉中表達，甚至僅在根中表達，即可進行人為地控制。

農桿菌Ti質體轉化系統轉化的外源基因以單拷貝為多數，遺傳穩定性好，並且多數符合孟德爾遺傳規律，因此轉基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料。

缺點：根癌農桿菌Ti質體載體系統作為一個植物基因轉化載體系統的不足之處是它主要用於雙子葉植物，如何擴大其應用範圍如禾穀類、裸子植物等，一直是人們所關心問題。